網(wǎng)易科技訊5月19日消息，未來(lái)論壇聯(lián)合科學(xué)、醫(yī)藥、臨床等領(lǐng)域內(nèi)的知名專家打造的“《理解未來(lái)》科學(xué)講座：病毒與人類健康-專題科普”的第十期直播中，北京未來(lái)基因診斷高精尖創(chuàng)新中心副主任、北京大學(xué)教授黃巖誼為我們帶來(lái)《新型冠狀病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)》的主題分享。黃教授介紹了檢測(cè)新冠病毒的技術(shù)方法、原理、結(jié)果判斷及實(shí)際應(yīng)用上的局限性。他表示：新冠病毒的檢測(cè)主要分為核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)，這兩個(gè)檢測(cè)方法完全不一樣，目的不同，采樣不同，方法不同，結(jié)果解讀不一樣，適用范圍也不同。分子診斷對(duì)于疾病診斷來(lái)說(shuō)是重要的組成部分。疾病的診斷是一個(gè)復(fù)雜問(wèn)題，尤其是對(duì)新發(fā)傳染病來(lái)說(shuō)，在已知病原體的情況下分子診斷成為極為重要的指標(biāo)。狹義的分子診斷一般來(lái)說(shuō)就是核酸檢測(cè)，包括對(duì)特定核酸片段的定性和定量分析，利用核酸雜交芯片、測(cè)序技術(shù)等等做序列分析。如果要拓展成廣義的分子診斷，也許還可以涵蓋其它和傳統(tǒng)病理診斷相對(duì)應(yīng)的分子病理技術(shù)包括抗體檢測(cè)等。不過(guò)約定俗成，一般情況下我們說(shuō)分子診斷就是說(shuō)核酸檢測(cè)。在傳染病檢測(cè)中，核酸檢測(cè)是指檢驗(yàn)樣品中間是否含有特定序列的DNA或者RNA的片段，作為病原微生物存在的證據(jù)。

同時(shí)，他表示：核酸檢測(cè)的最常見(jiàn)樣本是鼻咽拭子，采樣需要專業(yè)手法。一個(gè)多月前，華西醫(yī)院提出了用唾液進(jìn)行新冠診斷的可能性。這是一個(gè)比較容易實(shí)現(xiàn)自我采樣的操作。美國(guó)FDA也已批準(zhǔn)用在家采集的唾液樣本用于新冠檢測(cè)。此外，美國(guó)耶魯大學(xué)比較了唾液和鼻咽拭子PCR核酸檢測(cè)的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，和鼻咽拭子比，唾液采樣的穩(wěn)定性相當(dāng)不錯(cuò)，甚至更好一些。這是一個(gè)很好的起點(diǎn)。

談及抗體檢測(cè)，黃巖誼教授表示：抗體檢測(cè)的樣本是血或血清，快速檢測(cè)試劑盒可以利用膠體金顯色進(jìn)行試紙檢測(cè)，類似于驗(yàn)孕試紙。這個(gè)方法的好處是非常簡(jiǎn)單、易用、便宜，而且不需要復(fù)雜的設(shè)備，速度非常快。

以下分享的就是黃巖誼的演講全文（有刪減）：

黃巖誼：大家好，我是黃巖誼。我在北京大學(xué)工作，現(xiàn)在是北京未來(lái)基因診斷高精尖創(chuàng)新中心的研究員，副主任；我也是北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心的研究員，北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院教授。我主要從事生命分析化學(xué)的研究，尤其是微量核酸的分析技術(shù)研究，集中在基因測(cè)序方法、單細(xì)胞分析和微流控技術(shù)幾個(gè)方向上。應(yīng)未來(lái)論壇的邀請(qǐng)，我來(lái)給大家聊一聊新冠病毒的檢測(cè)問(wèn)題。

這是2019年12月31日新年鐘聲敲響之前的兩小時(shí)，我在北大拍的照片。湖面結(jié)了冰，未名湖上的反光，是博雅塔上亮著燈。那一天我比較忙，沒(méi)有看新聞消息；后來(lái)發(fā)現(xiàn)有一個(gè)新聞，在武漢出現(xiàn)了不明原因的肺炎。等我知道這個(gè)消息的時(shí)候可能大家都知道了。我不用微博，所以消息來(lái)源總是慢半拍。隨后幾天我們慢慢得到很多新聞消息的推送，我也開(kāi)始關(guān)心這個(gè)消息，雖然我當(dāng)時(shí)并不知道這個(gè)突發(fā)的情況會(huì)不會(huì)影響到我的生活。大概一周時(shí)間之后，肺炎元兇已經(jīng)確定了，這時(shí)候我開(kāi)始比較關(guān)注它了。為什么呢？因?yàn)槭且粋€(gè)新型冠狀病毒，雖然我不懂冠狀病毒是什么，但是這里說(shuō)得到了該病毒的全基因組序列，這個(gè)我就有興趣了，因?yàn)槲沂亲鰷y(cè)序研究的科研工作者。當(dāng)我看到從序列來(lái)確定病毒的時(shí)候，我想這真是很了不起的。從我看到這個(gè)新聞，到得到最終結(jié)果才過(guò)去不到一星期的時(shí)間，這是非常難以想象的快速度，僅僅只用了幾天時(shí)間，我們就確定了新的病原體。

回想一個(gè)病原體的確定過(guò)程，如果是一個(gè)新傳染病，該怎么做呢？這從來(lái)都不是一件容易的事情。一開(kāi)始網(wǎng)上傳的消息說(shuō)是SARS，也是我們常說(shuō)的非典，再次歸來(lái)。這次能夠這么快的發(fā)現(xiàn)它不是SARS，而是個(gè)全新的病毒，還跟SARS很接近，得益于過(guò)去十五年左右的時(shí)間內(nèi)，高通量DNA測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展。通常鑒定一個(gè)疾病的病原，要符合所謂的科赫法則。也就是說(shuō)，首先要找到宿主體內(nèi)的致病微生物，發(fā)現(xiàn)它不存在于健康生物體內(nèi)；要想辦法分離出來(lái)，得到它的純培養(yǎng)物，重新接種到宿主體內(nèi)，再次分離得到這個(gè)培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)這個(gè)培養(yǎng)物接種的宿主必定會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，等等。科赫法則是在130年前正式發(fā)表的，到現(xiàn)在為止還主導(dǎo)著絕大多數(shù)傳染病病原體的診斷標(biāo)準(zhǔn)。只不過(guò)隨著科技的發(fā)展，在新時(shí)代到來(lái)的時(shí)候，隨著基因組學(xué)的快速發(fā)展，很多法則用到了新的病原體鑒定的時(shí)候，有了新的變化。

舉個(gè)例子，比如說(shuō)肺炎吧，它的癥狀，通常是患者肺泡內(nèi)充滿液體出現(xiàn)氧合不良。肺炎是什么病原體導(dǎo)致的呢？可以說(shuō)有很多。除了最常見(jiàn)肺炎鏈球菌之外，還有很多病原體可以引起肺炎。比如說(shuō)這些下圖所示的各種病原體，我從網(wǎng)上查來(lái)的，都有可能引起肺炎。

總的來(lái)說(shuō)，分成病毒、細(xì)菌和少數(shù)真菌這三大類。病毒是里面最麻煩的，因?yàn)樗貏e的小。病毒跟人類相伴了很長(zhǎng)的時(shí)間，人類文明史上從來(lái)沒(méi)有間斷過(guò)，一直有它的存在，很難對(duì)付。病毒在地球上待的時(shí)間比我們長(zhǎng)多了，隨著人類文明的一步一步發(fā)展，它永遠(yuǎn)跟著我們走。現(xiàn)在由于疫苗的大量普及而慢慢少見(jiàn)的脊髓灰質(zhì)炎，也就是小兒麻痹癥，也是花了半個(gè)多世紀(jì)的時(shí)間才基本根除。幾個(gè)月前看到世界衛(wèi)生組織的新聞，宣布在世界范圍內(nèi)消滅脊髓灰質(zhì)炎Ⅲ型野病毒，這是一個(gè)亞型被完全消滅。病毒難以對(duì)付的一個(gè)原因，是它特別小，它的尺度和肉眼所及的尺度是很不相配的；肉眼是看不到病毒的，數(shù)量級(jí)相差太多了。光學(xué)顯微鏡出現(xiàn)之后大大幫助了生物學(xué)家和病理學(xué)家找病原體，它幫助科赫確定了結(jié)核桿菌、霍亂弧菌這些病原體，但是他沒(méi)有辦法用這些工具來(lái)發(fā)現(xiàn)病毒這個(gè)病原體，這超出了光學(xué)顯微鏡的極限。直到1939年到1940年間，德國(guó)科學(xué)家Ruska第一次在電子顯微鏡下看到了病毒顆粒，有煙草花葉病毒、牛痘病毒等。這不得不感謝大他兩歲的哥哥，他哥哥是電子顯微鏡的發(fā)明人，后來(lái)晚年得了諾貝爾獎(jiǎng)。這次我們對(duì)新冠病毒的確定，也多虧了這些新技術(shù)的發(fā)展。

讓我們回到今年一月份。一月下旬，幾篇中國(guó)科學(xué)家撰寫(xiě)的科學(xué)論文相繼面世，使得我們可以全面了解這一個(gè)新的病原體。新聞報(bào)導(dǎo)，只是新聞，但是讀科學(xué)論文，可以感受到細(xì)節(jié)的重要性。首先，1月24日的《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上，我們看到了這個(gè)病毒的全基因組序列。從序列上，生物學(xué)家可以很明確地判斷這是冠狀病毒，而且從序列分析上可以判定這是一個(gè)新病毒，在人類歷史上以前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)過(guò)的新病毒，歸屬到Beta屬，是感染人類的冠狀病毒科的第七個(gè)成員。

上圖是第一次科學(xué)論文中展示新冠病毒的透射電子顯微鏡照片，可以看到它個(gè)頭很小——對(duì)照比例尺，它的大小只有100nm左右，但是長(zhǎng)相和其他冠狀病毒非常相似。

同一天，《柳葉刀》雜志上發(fā)表了由中國(guó)醫(yī)科院病原所王健偉教授和中日友好醫(yī)院曹彬主任的團(tuán)隊(duì)對(duì)新冠患者的臨床特征的研究結(jié)果。這里第一次提到對(duì)病人確診的時(shí)候使用了一個(gè)技術(shù)，即RT-PCR方法，來(lái)進(jìn)行核酸檢測(cè)。種種跡象表明這是一種新疾病，給我們帶來(lái)了新挑戰(zhàn)；不僅給科學(xué)帶來(lái)了新挑戰(zhàn)、給醫(yī)學(xué)帶來(lái)新挑戰(zhàn)，也給病人帶來(lái)新挑戰(zhàn)。

第三篇重要的論文，是在我們中國(guó)自己的期刊《中華醫(yī)學(xué)雜志》上發(fā)表的，這篇文章很系統(tǒng)地描述了新冠病毒的特征。在隨后在中國(guó)科學(xué)報(bào)的新聞中，可以看到這個(gè)病原鎖定的過(guò)程，非常地迅速、高效。幾個(gè)團(tuán)隊(duì)平行行動(dòng)，開(kāi)始進(jìn)行測(cè)序，使得結(jié)果的可靠性大大增加。在血清學(xué)的研究中，還揭示了病毒與患者恢復(fù)期的血清之間的抗原抗體反應(yīng)，這是一篇很完整的科學(xué)論述。

第四篇，是這三個(gè)平行檢測(cè)中的另一個(gè)團(tuán)隊(duì)，武漢病毒所的團(tuán)隊(duì)。他們的結(jié)果，和之前其它團(tuán)隊(duì)的一樣，得到了幾個(gè)病毒的全序列。

另外一個(gè)重要結(jié)果是右邊這些彩色的光學(xué)顯微鏡展示（上圖）人的ACE2蛋白是病毒侵犯人體細(xì)胞的重要途徑，這對(duì)于病毒致病機(jī)制研究和治療以及藥物開(kāi)發(fā)都提供了重要的線索。

第五篇論文是和上一篇同時(shí)發(fā)表的，上海團(tuán)隊(duì)，從早期武漢一個(gè)單個(gè)病人身上獲得樣本，通過(guò)高通量測(cè)序方法，得到了病毒的全序列，拿它和SARS病毒的序列作了比較。正是由于中國(guó)科學(xué)家們?cè)?月份第一周之內(nèi)快速響應(yīng)和高質(zhì)量的工作，很快病毒的參考基因組得到了。通過(guò)參考基因組，我們就有了坐標(biāo)系。

首先，可以理解病毒基因組的每一段序列是干什么。比如上圖標(biāo)記出來(lái)得道道，就是一個(gè)個(gè)基因，用來(lái)編碼一段一段有功能得蛋白，行使特定的功能，有的是讓病毒可以復(fù)制，有的是讓病毒有利于侵入人體，有的是構(gòu)建病毒的結(jié)構(gòu)框架。其次，有了這個(gè)參考坐標(biāo)，以后病毒再發(fā)生了變異，我們就知道什么地方發(fā)生了什么變異，這對(duì)我們更深度的理解病毒生物學(xué)的基本功能，以及它的自然史，以及疾病發(fā)生與發(fā)展有非常重要的意義。

上圖是病毒基因組編碼的主要蛋白質(zhì)，展示的是預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，是美國(guó)密歇根大學(xué)張陽(yáng)教授團(tuán)隊(duì)的結(jié)果。從這里可以看到，這有個(gè)很重要的蛋白，叫做Spike protein（S蛋白），還有別的比如M蛋白、N蛋白等等，這些不同的蛋白是這個(gè)病毒中非常特異表達(dá)的蛋白質(zhì)。通過(guò)這些結(jié)果可以構(gòu)建出來(lái)，現(xiàn)在經(jīng)常可以在新聞中看到的新冠病毒的模型圖，病毒外表上這些蛋白一般就是我指的這些蛋白，這些蛋白給病毒特定的功能，不僅給它一個(gè)結(jié)構(gòu)支撐，而且對(duì)我們做檢測(cè)來(lái)說(shuō)也能成為我們重要的目標(biāo)。我們可以通過(guò)檢測(cè)這些病毒的特定成分例如目標(biāo)蛋白或者編碼這些蛋白的基因來(lái)確定病毒的存在。

正是由于我們對(duì)于病毒的序列的解讀，我們馬上就可以知道它和17年前的宿敵SARS冠狀病毒是近親。都不需要告訴大家怎么看這個(gè)圖，可以看出它們是蠻像的。它不僅和SARS很像，和10年前的MERS也有關(guān)系。這也說(shuō)明了我們不能小瞧這個(gè)病毒，它可能具有巨大的破壞力。由于與SARS的相似性，國(guó)際病毒命名委員會(huì)，將原來(lái)我們把它叫做2019新型冠狀病毒改名嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2即SARS-CoV-2。SARS-CoV-2表明它跟原來(lái)SARS病毒之間的關(guān)聯(lián)性還是比較近的。前不久德國(guó)科學(xué)家的論文也說(shuō)明這個(gè)新的SARS冠狀病毒和原先的SARS病毒確實(shí)在攻擊細(xì)胞的時(shí)候采用的策略極為相似，通過(guò)進(jìn)攻同樣的蛋白來(lái)侵入細(xì)胞。而且還發(fā)現(xiàn)之前SARS病毒的抗體對(duì)新病毒也具有一定的中和作用，揭示兩種病毒的高度相關(guān)性。

進(jìn)入生物分子學(xué)的時(shí)代，對(duì)于傳染病的認(rèn)識(shí)開(kāi)始變化，都從分子水平理解開(kāi)始。知道了冠狀病毒，就不像2003年那樣，那時(shí)我們一開(kāi)始還不能確定病原體，叫它非典型性肺炎。現(xiàn)在國(guó)際衛(wèi)生組織命名這個(gè)新的疾病為“2019冠狀病毒病（COVID-19）”，即由冠狀病毒感染引起的疾病，而不是用簡(jiǎn)單癥狀來(lái)命名。我們國(guó)家衛(wèi)健委的命名還是“新型冠狀病毒肺炎”。所以大部分時(shí)候我們?cè)谥袊?guó)，還是用新冠肺炎來(lái)稱呼COVID-19。

上圖是香港大學(xué)的科學(xué)家1月份看到的冠狀病毒，這個(gè)病毒已經(jīng)完成了復(fù)制，從細(xì)胞里面釋放出來(lái)。

上圖是2月份美國(guó)科學(xué)家拍攝的冠狀病毒的大頭照，可以清晰的看到表面“花冠的出現(xiàn)”，這是一個(gè)偽彩照片，很好的標(biāo)出了“花冠”的存在。

前不久美國(guó)疾控中心發(fā)布新的冠狀病毒的集體照（如上圖），藍(lán)色標(biāo)出來(lái)的是病毒顆粒，病毒顆粒里的小黑點(diǎn)就是切開(kāi)了的斷面上的核酸，就是這些冠狀病毒里包含了基因組的部分。這個(gè)基因組對(duì)于我們做檢測(cè)有極其重要的意義，是我們檢測(cè)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

分子診斷對(duì)于疾病診斷來(lái)說(shuō)是重要的組成部分，疾病診斷是復(fù)雜問(wèn)題，尤其是新疾病出現(xiàn)的時(shí)候，對(duì)于一個(gè)傳染病來(lái)說(shuō)，已知病原體的情況下分子診斷成為極為重要的指標(biāo)。它的主要目的有以下幾個(gè)：第一，它確定臨床癥狀，比如發(fā)燒是否是由新冠病毒引起的，避免它和其他疾病混淆起來(lái)。第二，對(duì)疾病的進(jìn)程進(jìn)行定性（比如陽(yáng)性陰性）或者定量描述，比如病毒載量的多少。第三，從更加精細(xì)的角度出發(fā)，某些分子診斷還可以提供疾病的治療方案，幫助確定它的方案，提供證據(jù)的支撐。第四，從病毒疾病的角度出發(fā)，可以追蹤變異情況，這也非常重要，研究并且預(yù)測(cè)病毒在傳播過(guò)程中的傳染和致病能力的演化，比如我的同事北京大學(xué)陸劍老師的文章，他指出有一些關(guān)聯(lián)性特別密切的突變位點(diǎn)，很可能和疾病的愈后之間有著非常緊密的指征性連接，所以很可能對(duì)以后疾病的救治，以及理解病毒怎么跟宿主共同生存有很重要的意義。

什么是分子診斷？狹義的分子診斷一般來(lái)說(shuō)就是核酸檢測(cè)，包括對(duì)特定核酸片段的定性和定量分析，利用核酸雜交芯片、測(cè)序技術(shù)等等做序列分析。如果要拓展成廣義的分子診斷，也許還可以涵蓋其它和傳統(tǒng)病理診斷相對(duì)應(yīng)的分子病理技術(shù)包括抗體檢測(cè)等。不過(guò)約定俗成，一般情況下我們說(shuō)分子診斷就是說(shuō)核酸檢測(cè)。核酸檢測(cè)是指檢驗(yàn)樣品中間是否含有特定序列的DNA或者RNA的片段，作為病原微生物存在的證據(jù)。除了病原微生物的分子診斷外，這一方法在疫情之前就已經(jīng)被用的很普遍了，比如說(shuō)大量的其他感染性疾病的診斷、遺傳疾病的診斷、腫瘤的分型、化療用藥的指導(dǎo)等很多醫(yī)療實(shí)踐中都用到核酸，只不過(guò)那時(shí)候沒(méi)有像今天提的這么多而已。

除此之外我們針對(duì)抗體做檢測(cè)就是抗體檢測(cè)，抗體檢測(cè)看的不是病毒本身，而是看血液中間或者體液中間有沒(méi)有抗體分子的出現(xiàn)。

還有一種檢測(cè)是抗原檢測(cè)，目標(biāo)是病毒身上的物質(zhì)，比如我們上圖中看到的藍(lán)色標(biāo)記的這兩個(gè)地方，這兩個(gè)都是病毒獨(dú)有的蛋白，刺突S蛋白和核衣殼N蛋白，看他們是否存在于樣品中，就是抗原檢測(cè)。這都是基于我們要檢測(cè)的時(shí)候的物質(zhì)基礎(chǔ)。

檢測(cè)，歸根到底是針對(duì)分子的測(cè)量，測(cè)量分子數(shù)量的多少；這是由病毒本身的結(jié)構(gòu)和組成來(lái)決定的，都有其物質(zhì)基礎(chǔ)。這幾位以色列和美國(guó)的科學(xué)家，把冠狀病毒的一些關(guān)鍵數(shù)據(jù)列了出來(lái)。從檢測(cè)上講，除了核酸分子（上圖中綠色箭頭標(biāo)出來(lái)的），它是每個(gè)病毒里有一條分子外，還有很多蛋白質(zhì)分子（幾個(gè)紅色箭頭標(biāo)出來(lái)的），在病毒里數(shù)量很多。但是這些分子的數(shù)目分布還是有區(qū)別的，S蛋白，大概每個(gè)病毒有上百個(gè)；N蛋白和M蛋白每個(gè)病毒有上千個(gè)。對(duì)這些數(shù)量的了解非常有助于我們今后發(fā)展特異性的檢測(cè)技術(shù)來(lái)確定病毒的存在。

從新冠病毒肺炎的第七版診療方案中可以看到，診斷指標(biāo)列的非常明確，在病原體上的證據(jù)有兩項(xiàng)，一是熒光RT-PCR，二是基因測(cè)序。病毒的核酸序列特征和其他物種比如動(dòng)物和人的核酸序列大不相同，通過(guò)這兩個(gè)方法可以對(duì)序列鑒別不太容易出錯(cuò)。隨著疫情的發(fā)展以及我們對(duì)病毒自然史認(rèn)識(shí)的加深，診療方案調(diào)整到后期的時(shí)候，把血清學(xué)檢測(cè)也加上了，我們以后再講。

關(guān)于檢測(cè)，國(guó)家衛(wèi)健委的通報(bào)和藥監(jiān)局的審批一直都是圍繞核酸和抗體進(jìn)行。這兩個(gè)檢測(cè)方法完全不一樣，目的不同，采的樣品來(lái)源不同，檢測(cè)方法不同，結(jié)果解讀不一樣，適用范圍也不同。下面稍微介紹一下這兩個(gè)方法。

核酸檢測(cè)，首先是采樣。

現(xiàn)在接受核酸檢測(cè)的人多了，大家看的新聞也多了，看到上圖這樣的圖片不會(huì)覺(jué)得太新鮮了。事實(shí)上我自己去年以前沒(méi)有體驗(yàn)過(guò)咽拭子是怎么回事兒。更多人只是在圖片上看到過(guò)這樣的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，并沒(méi)有真正的體會(huì)過(guò)。真實(shí)過(guò)程比圖片展示的可能還要復(fù)雜一些。采樣，一般都在實(shí)驗(yàn)室外相對(duì)空曠的地方，采樣人員必須經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)，還要注意防護(hù)。因?yàn)檫@是有風(fēng)險(xiǎn)的操作，不僅僅面對(duì)有可能帶傳染能力的感染者，還包括采樣過(guò)程中本身會(huì)增加暴露的風(fēng)險(xiǎn)。比如采樣中打個(gè)噴嚏或者咳嗽，都會(huì)增加暴露風(fēng)險(xiǎn)。

要確保采樣成功有兩個(gè)關(guān)鍵，一個(gè)是使用的材料即拭子是有講究的，不是隨便一個(gè)棉簽就可以；同時(shí)，拭子采樣后的保存環(huán)境也是有講究的。另外采樣本身的操作是有講究的，手法也重要，也不能過(guò)去一捅就能夠采到。采樣的部位選擇和操作都是獲取高質(zhì)量樣本的基礎(chǔ)，只有樣本質(zhì)量好，才有可能做出可靠的檢測(cè)。舉個(gè)例子，最常見(jiàn)的樣品就是鼻咽拭子，注意采樣的拭子要一直伸到鼻咽部的最后面，在口咽部的上方。這不是一個(gè)很容易的操作，很講究經(jīng)驗(yàn)和手法，自己做也是有困難的，一般也不推薦自己這么采樣。還有喉咽拭子，張開(kāi)嘴，也是要將很長(zhǎng)的拭子深入到口腔后部，在咽喉部位，扁桃體邊上。這個(gè)取樣也不是自己可以簡(jiǎn)單做的，通常還要把舌頭壓下去。為什么采樣這樣講究？因?yàn)椴蓻](méi)采到、采沒(méi)采好，直接決定了你做的檢測(cè)到底能不能看到可靠的結(jié)果。

采樣部位的不同反映在檢測(cè)結(jié)果上也不一樣，中國(guó)科學(xué)家們很早就總結(jié)了一些規(guī)律。

比如，從上圖a，看得出來(lái)隨著癥狀的進(jìn)展，慢慢的好像信號(hào)就下去了。隨著（出現(xiàn)癥狀之后）時(shí)間增加，采樣得到的核酸數(shù)量越來(lái)越少。另一個(gè)結(jié)果，從c圖上可以看到鼻咽拭子采到的核酸量會(huì)比喉咽拭子高一些，穩(wěn)定性也稍微好一些。早期得到的經(jīng)驗(yàn)對(duì)后面指導(dǎo)采樣的流程有重要的意義，就是應(yīng)該怎么采、采什么地方的樣品。

疾病的特點(diǎn)導(dǎo)致了病毒侵染部位有特點(diǎn)，既有偏好，也受發(fā)病時(shí)間的影響。實(shí)際上，作為檢測(cè)，可以用各種樣品，不僅僅只是兩種拭子。第七版的診療方案中明確提出了鼻咽拭子、痰、其他下呼吸道分泌物、血液、糞便的標(biāo)本中都可以測(cè)出病毒核酸。還有調(diào)查研究表明，這么多的論文總結(jié)起來(lái)，看上去在很多樣品中比如眼淚、糞便中都可能檢測(cè)到核酸病毒，但這里面痰液或下呼吸道分泌物是最不容易漏檢的，也就是檢出率是最高的，接下來(lái)就是鼻咽拭子。所以可以發(fā)現(xiàn)真正做高質(zhì)量的測(cè)量研究中，對(duì)樣品的來(lái)源非常考究，要求一定要保證樣品采樣的質(zhì)量，只有拿到好的樣品才可能得到好結(jié)果。世界衛(wèi)生組織在1月份就有指導(dǎo)文件，對(duì)不同樣品的采集、保存、用途都做了很好的梳理，有了這樣的指南，世界各地的科研人員和醫(yī)務(wù)人員都可以遵循相對(duì)正規(guī)可靠的流程，來(lái)保證結(jié)果的可靠性。

樣品采集后做檢測(cè)，第一步通常是核酸提取，就是把樣品中的核酸部分留下，其他部分雜質(zhì)、人脫落的細(xì)胞、其他分子如蛋白質(zhì)分子等等都除掉。通常的核酸提取，采用的都是把核酸分子用和它親和力強(qiáng)的材料，例如硅膠等，先吸附；等到把其它物質(zhì)都分離掉后，在把吸附的核酸分子洗脫下來(lái)，實(shí)現(xiàn)了提取，同時(shí)也是純化和富集的步驟。這里可以采用的，在實(shí)驗(yàn)室里面，有兩個(gè)方法。這兩個(gè)方法現(xiàn)在在新冠病毒的核酸檢測(cè)中，都廣泛使用。要么使用硅膠膜來(lái)吸附，要么利用表面修飾的磁性小顆粒來(lái)實(shí)現(xiàn)吸附。這個(gè)步驟看上去很簡(jiǎn)單，但是這里最關(guān)鍵的一點(diǎn)，是要考慮到生物安全。有興趣的觀眾，可以看中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院的培訓(xùn)教學(xué)視頻，這個(gè)視頻完整的演示了怎么做核酸提取，也強(qiáng)調(diào)了操作人員的生物安全問(wèn)題。為了保證這一點(diǎn)，特別指出所有樣品在操作前要先置于56度的水浴箱里進(jìn)行30分鐘滅活，使病毒失去感染能力。國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南》也說(shuō)，未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作需要這么做，應(yīng)當(dāng)保持在生物安全二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，同時(shí)采用生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)。

上圖美國(guó)CDC的卡通圖。生物安全三級(jí)，簡(jiǎn)單說(shuō)是在封閉空間在采用負(fù)壓，所有的空氣跟其他物質(zhì)不會(huì)沒(méi)有經(jīng)過(guò)處理直接外排到外界，這樣一個(gè)生物實(shí)驗(yàn)環(huán)境。里面的人員和我們常在電視里看到的全副武裝的白衣戰(zhàn)士差別不大，都是一樣的裝束，只會(huì)更加嚴(yán)格，需要完全沒(méi)有暴露的身體部位。生物二級(jí)要求沒(méi)有那么嚴(yán)格，空氣和外界有交換，有時(shí)在個(gè)別區(qū)域可以增加生物安全等級(jí)，做要求更高的實(shí)驗(yàn)。這次吳晨老師帶領(lǐng)的武漢的方艙檢測(cè)國(guó)家隊(duì)，就是在一個(gè)移動(dòng)的生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室工作的。

上圖是吳晨教授在武漢現(xiàn)場(chǎng)工作的照片。左邊的工作環(huán)境是生物安全二級(jí)，右邊那個(gè)車是移動(dòng)的生物安全三級(jí)的實(shí)驗(yàn)室，吳晨老師的打扮是標(biāo)準(zhǔn)的生物安全三級(jí)的打扮，如果不是有名字寫(xiě)在那里，其實(shí)你并不知道她是誰(shuí)。全副武裝做實(shí)驗(yàn)，是出于生物安全的考慮。

核酸提取之后是擴(kuò)增的步驟，這是通過(guò)廠家提供的幾管試劑實(shí)現(xiàn)的。上圖中左邊是華大基因的試劑，里面是幾個(gè)小試管，右邊是美國(guó)疾控中心分發(fā)的試劑，里面也是幾個(gè)小試管。檢測(cè)的過(guò)程叫做RT-PCR，就是逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。這是一個(gè)利用自然中存在的核酸復(fù)制機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)DNA分子的體外復(fù)制的操作，已經(jīng)發(fā)明了近四十年，是分子診斷的基礎(chǔ)技術(shù)，也是現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)進(jìn)步的重要奠基性技術(shù)。在每一個(gè)試管中，除了加待測(cè)樣品就是核酸提取液外，還要加DNA聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，以及引物和探針。新冠病毒是RNA病毒，病毒里面包裹這一條基因組RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶把這條RNA變成和它互補(bǔ)的DNA，然后再?gòu)?fù)制一遍，變成雙鏈DNA，再往后就可以通過(guò)熱循環(huán)一遍一遍的解開(kāi)配對(duì)的雙鏈，分別復(fù)制。1變2、2變4、4變8，經(jīng)過(guò)N輪循環(huán)，理論上可以得到幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)的特定片斷的DNA。在復(fù)制的過(guò)程中，一個(gè)巧妙設(shè)計(jì)使每一次的復(fù)制能產(chǎn)生特定的熒光分子，復(fù)制的分子越多產(chǎn)生的熒光越多，我們就可以檢測(cè)到這信號(hào)，這樣一輪一輪的復(fù)制下去，我們看熒光增長(zhǎng)。如果有熒光增長(zhǎng)就是有待測(cè)物質(zhì)，即所謂陽(yáng)性；沒(méi)有增長(zhǎng)就是沒(méi)有待測(cè)物質(zhì)即所謂的陰性。熒光增長(zhǎng)越快，就說(shuō)明分子越多，增長(zhǎng)越慢，說(shuō)明分子越少，大概就這樣一個(gè)過(guò)程。

這個(gè)過(guò)程歷時(shí)不太長(zhǎng)時(shí)間，能夠給出這樣一個(gè)圖來(lái)（如上圖），劃一條線切過(guò)去，與熒光強(qiáng)度曲線交叉得到的值如果是低的證明你可能是陽(yáng)性，這個(gè)值太高了或者沒(méi)有出現(xiàn)（上升）證明是陰性。

這個(gè)判斷在實(shí)際上還是有講究的，做的過(guò)程中一定要加質(zhì)控品，陰性質(zhì)控和陽(yáng)性質(zhì)控都要有。一般來(lái)說(shuō)陰性的就是純凈的水，里面不應(yīng)該有待測(cè)的核酸，不應(yīng)該出信號(hào)；如果出了信號(hào)，這次實(shí)驗(yàn)的可靠性就有問(wèn)題。陽(yáng)性的，一般是一個(gè)低濃度的樣品，如果我們沒(méi)有測(cè)出信號(hào)，證明這次實(shí)驗(yàn)不夠靈敏，也許哪里有問(wèn)題了，需要檢查和重做。

另外，選擇探針序列也就是引物序列非常講究，在大概3萬(wàn)個(gè)堿基左右長(zhǎng)度的序列，檢測(cè)哪一段還是需要下一番功夫的。一組韓國(guó)科學(xué)家，前不久發(fā)表了一個(gè)對(duì)比結(jié)果，把一月份就分別采用的核酸檢測(cè)的檢測(cè)位點(diǎn)，的有效性做了一個(gè)相對(duì)客觀的比較。各國(guó)科學(xué)家確定的用來(lái)做診斷的位點(diǎn)，是有區(qū)別的。上面這里，我標(biāo)出了這些檢測(cè)的核酸片段在基因組中的位置，比如中國(guó)的兩個(gè)位點(diǎn)，一個(gè)是ORF1ab，另一個(gè)是N；而美國(guó)的三個(gè)，都在N蛋白基因上；德國(guó)的，一個(gè)在RdRp基因上，一個(gè)在E基因上。

上圖是N基因的一段序列，里面用顏色表示的是，各個(gè)國(guó)家檢測(cè)的位點(diǎn)，所使用引物的位置。可以看出，少量位置，各個(gè)國(guó)家的科學(xué)家們確定的有一些小的重疊，但是總的來(lái)說(shuō)，并不是精確在一起。結(jié)果很有意思，韓國(guó)科學(xué)家的對(duì)比實(shí)驗(yàn)提出來(lái)中國(guó)和美國(guó)選擇的位點(diǎn)是這些檢測(cè)中靈敏度最高的，這也從側(cè)面反映了我們科學(xué)家早期選擇位點(diǎn)的時(shí)候選的很準(zhǔn)，這是需要經(jīng)驗(yàn)的，需要能力，也需要做出科學(xué)判斷的。

核酸檢測(cè)是否還可以改進(jìn)？首先看速度，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的核酸檢測(cè)過(guò)程，取樣是很快的，然后把它存到運(yùn)送培養(yǎng)基里，把樣品攢到一定數(shù)量的時(shí)候，集中滅活，56度、30分鐘，然后進(jìn)行核酸提取；核酸提取差不多30-90分鐘，PCR反應(yīng)40-60分鐘，這個(gè)是可以一批樣品，常常96個(gè)一起做的，出來(lái)之后可以快速結(jié)果判定，整個(gè)實(shí)驗(yàn)做下來(lái)大概小半天的樣子。這個(gè)過(guò)程能不能加速？如果是單個(gè)樣品，樣品采集之后直接就做，可以跳過(guò)很多步驟，比如直接放到裂解液里面，然后做快速的核酸提取，甚至不做提取就做快速的PCR，這樣可能在30分鐘左右就拿到結(jié)果。可以看到，PCR檢測(cè)本身是可以做到快速的，尤其是樣品量少的時(shí)候可以這么做，但樣品多的時(shí)候最好是一批一批地操作更有效率。

我后面還會(huì)講到一些檢測(cè)方法，我們先看一下前幾天美國(guó)科學(xué)家的一個(gè)綜述，把最近報(bào)道的各種核酸檢測(cè)方法做了一個(gè)總結(jié)。

上圖可以看到，各種方法檢測(cè)所需的時(shí)間，大部分在一兩個(gè)小時(shí)內(nèi)都能做完，價(jià)格從幾美元到十幾美元。這里方法很多，有的已經(jīng)不再是所謂RT-PCR方法，但還是充分借用了大自然的力量，利用自然界遺傳物質(zhì)的復(fù)制機(jī)制，進(jìn)行特定的DNA片段的擴(kuò)增，最終達(dá)到足夠強(qiáng)的信號(hào)獲取。擴(kuò)增反應(yīng)本身可以通過(guò)各種巧妙的方法加以實(shí)現(xiàn)。除了RT-PCR這一被反復(fù)驗(yàn)證和優(yōu)化了20多年，被證明為極為可靠的臨床檢驗(yàn)方法之外，還有很多其他擴(kuò)增方法被發(fā)明出來(lái)，面對(duì)新冠病毒的檢測(cè)這些方法正在經(jīng)受嚴(yán)格的考驗(yàn)。基于對(duì)檢測(cè)速度的追求，即使是通過(guò)RT-PCR方法，為了減少操作上的技術(shù)壁壘和失誤，可以采用所謂POCT的設(shè)備，也就是可以在現(xiàn)場(chǎng)使用的小型儀器裝置。

上圖中的兩個(gè)是3月下旬的時(shí)候美國(guó)藥監(jiān)局最早批準(zhǔn)緊急使用的兩個(gè)儀器，分別可以在30分鐘或45分鐘內(nèi)完成從樣品到結(jié)果的檢測(cè)全流程。在傳染病流行期間利用這樣的設(shè)備至少有兩個(gè)重要好處，一個(gè)是分散處理病人檢測(cè)需求，避免樣品積壓和運(yùn)送困難。二是可以采用幾乎全封閉的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，減少了操作者的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。

上圖的儀器可能是這一類檢測(cè)儀器中最出風(fēng)頭的，這是美國(guó)超級(jí)銷售特朗普親自帶貨的小儀器，很可惜他沒(méi)有擺對(duì)，圖中不是正確的擺放方法。這個(gè)機(jī)器可以在5分鐘之內(nèi)給出陽(yáng)性結(jié)果，十幾分鐘給出陰性結(jié)果，真正使用的時(shí)候整體所花的時(shí)間實(shí)際上會(huì)再長(zhǎng)一些。要說(shuō)明的是，這不是一個(gè)新的發(fā)明，不是有了新冠病毒突然就冒出了這么一個(gè)新發(fā)明。這個(gè)儀器已經(jīng)在市面上很長(zhǎng)時(shí)間了，在被新東家雅培買走之前，它已經(jīng)是市場(chǎng)上用來(lái)檢測(cè)流感病毒微生物的便攜設(shè)備。

比如上圖，這篇2014年深圳福田醫(yī)院的科研人員參與的一篇論文，就是在評(píng)價(jià)這個(gè)儀器檢測(cè)流感的表現(xiàn)。這個(gè)儀器用的基本技術(shù)是一個(gè)相對(duì)冷門的擴(kuò)增方法，叫做NEAR（切口酶擴(kuò)增反應(yīng)），自然界存在很多奇奇怪怪的酶，可以做很多事情。切口酶就是在DNA切面上形成一個(gè)小切口，然后讓聚合酶找到那個(gè)地方，可以開(kāi)始做復(fù)制，不斷的形成切口，不斷的復(fù)制。這是非常巧妙的一個(gè)方法，不需要做PCR反應(yīng)和熱循環(huán)，屬于等溫?cái)U(kuò)增的一種。等溫?cái)U(kuò)增的意思，是不需要做熱循環(huán)，擴(kuò)增過(guò)程在一個(gè)恒定的溫度下進(jìn)行，好處是這個(gè)過(guò)程變得非常簡(jiǎn)單；另一個(gè)好處是快，因?yàn)榈葴財(cái)U(kuò)增的檢測(cè)常常都是幾分鐘、十幾分鐘的時(shí)間尺度下完成的。除了NEAR之外，還有很多等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)可以利用在核酸的檢測(cè)上。例如一個(gè)相對(duì)比較有名的LAMP環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，這是日本科學(xué)家Notomi等人在2000年左右發(fā)明的，這個(gè)方法也是用四個(gè)或者六個(gè)引物序列加到待測(cè)物質(zhì)里面，把它的溫度稍微升一點(diǎn)，通常會(huì)在60度左右的溫度下做等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，不需要很復(fù)雜的儀器很快就能做完。這個(gè)方法的一個(gè)好處是，設(shè)備可以做的很簡(jiǎn)單，可以很容易操作，肉眼就可以做判別。中國(guó)藥監(jiān)局也批準(zhǔn)了基于這類反應(yīng)的體外診斷試劑，例如這是成都博奧晶芯做的基于LAMP擴(kuò)增方式的新冠病毒診斷設(shè)備。

還有其他方法，其中一個(gè)方法是RPA，也是相對(duì)比較容易。它用兩種酶的組合，重組酶和聚合酶放在一起，通過(guò)一個(gè)很復(fù)雜的循環(huán)，實(shí)現(xiàn)核酸分子的擴(kuò)增，雖然復(fù)雜但是非常高效，非常快。基于RPA，在美國(guó)波士頓有名的華裔青年科學(xué)家張鋒，把它和基因編輯結(jié)合在一起，嫁接起來(lái)實(shí)現(xiàn)了對(duì)RNA的檢測(cè)，他們起了一個(gè)名字叫SHERLOCK（福爾摩斯的大名）還用這個(gè)名字注冊(cè)了企業(yè)，來(lái)做這個(gè)試劑的開(kāi)發(fā)。無(wú)獨(dú)有偶，在美國(guó)加州舊金山，基于LAMP方法，嫁接基因編輯，Jennifer Donna跟她的合作者一起也做了一個(gè)新方法，叫做DETECTR，成立的公司叫做Mammoth Biosciences。這兩個(gè)方法比較上看，它們大概都可以實(shí)現(xiàn)30分鐘到50分鐘的檢測(cè)，相對(duì)都是快的。這兩個(gè)方法可以用試紙條的形式來(lái)讀取結(jié)果，也很容易被大家所領(lǐng)會(huì)，不需要復(fù)雜儀器。

除了縮短時(shí)間，對(duì)于大規(guī)模的檢測(cè)，提高檢測(cè)通量是非常重要的，試劑盒可以拿來(lái)一盒就可以做好多檢測(cè)，但是樣品要一個(gè)一個(gè)測(cè)。還有核酸提取這樣原來(lái)特別消耗體力而且需要經(jīng)驗(yàn)、技巧、訓(xùn)練的工作，最好交給不知疲倦、不容易犯錯(cuò)的機(jī)器來(lái)操作。所以我們看到核酸提取自動(dòng)化儀器大量出現(xiàn)在檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)，這樣的儀器遍布在各個(gè)定點(diǎn)醫(yī)院，各級(jí)的疾控中心。

上圖右邊這兩個(gè)儀器是在美國(guó)的大學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，現(xiàn)在大學(xué)實(shí)驗(yàn)室大量加入到大規(guī)模檢測(cè)的隊(duì)列中來(lái)，能夠消除一些檢測(cè)滯后的焦慮。如果是一個(gè)集中處理的大型檢測(cè)結(jié)構(gòu)，就要用更加完整的自動(dòng)化的儀器才好用。

上圖是羅氏公司做的巨無(wú)霸儀器，Cobas8800，一臺(tái)這樣的機(jī)器，一天不停機(jī)大概可以完成3000個(gè)核酸檢測(cè)，而且?guī)缀跞詣?dòng)，把樣品放進(jìn)去之后就開(kāi)始做。這有什么好處呢？除了快之外，還有一個(gè)重要的好處是可以保證在世界上不同地點(diǎn)，大家取得的結(jié)果都是基本可靠和穩(wěn)定的。這樣，在基礎(chǔ)比較薄弱、積累不夠雄厚的地方，一樣可以實(shí)現(xiàn)高品質(zhì)的大規(guī)模檢測(cè)。在肯尼亞、在加拿大、在美國(guó)、在中國(guó)，得到檢測(cè)結(jié)果不會(huì)由于操作問(wèn)題而出現(xiàn)大的偏差。

隨著疫情進(jìn)展，越來(lái)越多的檢測(cè)需求出現(xiàn)了。隨著居家隔離變成常態(tài)，自我檢測(cè)、自我采樣能不能可行？在美國(guó)第一個(gè)獲得藥監(jiān)局批準(zhǔn)的居家自助采樣試劑盒產(chǎn)品是LabCorp公司的產(chǎn)品Pixel，它用棉簽在鼻腔中抹一下，然后寄回到檢測(cè)中心做大規(guī)模檢測(cè)，這樣就不需要做很復(fù)雜的采樣。目前，還沒(méi)有看到大規(guī)模的評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)出現(xiàn)。但是畢竟拿棉簽捅鼻子，是不太容易做到很好的穩(wěn)定性的，所以一個(gè)多月前，華西醫(yī)院的科研人員提出了用唾液進(jìn)行新冠診斷的可能性。這是一個(gè)比較容易的自我采樣的操作。不到一個(gè)月前，美國(guó)耶魯大學(xué)的科學(xué)家發(fā)表了一篇論文，比較了唾液和鼻咽拭子PCR核酸檢測(cè)的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，和鼻咽拭子比，唾液采樣的穩(wěn)定性相當(dāng)不錯(cuò)，甚至更好一些。另外更有意思的是絕大多數(shù)患者上看到的結(jié)果，唾液中檢測(cè)的病毒更多一些，結(jié)果可能更加準(zhǔn)確，減少假陰性的出現(xiàn)。這是一個(gè)很好的起點(diǎn)，所以前幾天美國(guó)新澤西的Rutgers大學(xué)以及他們下屬的檢測(cè)機(jī)構(gòu)獲得了美國(guó)藥監(jiān)局的批準(zhǔn)，開(kāi)始使用唾液采集的樣品來(lái)進(jìn)行新冠病毒的檢測(cè)。他們采用了一個(gè)流水線式的大規(guī)模處理的自動(dòng)化機(jī)器，可以每天檢測(cè)1萬(wàn)份樣本。唾液采樣檢測(cè)是非常令人鼓舞的新方法，如果得到推廣有望很好地解決我們過(guò)去采樣中的面臨的問(wèn)題。

隨著疫情的第一個(gè)高峰過(guò)去，復(fù)工復(fù)學(xué)的階段到來(lái)，抗體檢測(cè)成為新的流行語(yǔ)。抗體檢測(cè)是如何進(jìn)行的？我發(fā)現(xiàn)前面九期都是跟這些問(wèn)題相關(guān)的講座，大家肯定已經(jīng)比我更加清楚什么是抗體了。所以我就從技術(shù)上講講抗體檢測(cè)是怎么做的。

首先樣本大不一樣，都是用血或者血清進(jìn)行的檢測(cè)。抗體檢測(cè)的方法多種多樣，最常見(jiàn)的就是酶聯(lián)免疫吸附和免疫化學(xué)發(fā)光法。這兩個(gè)方法的原理非常像，也是實(shí)驗(yàn)室研究最常見(jiàn)的檢測(cè)方式。以酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)原理為例，在檢測(cè)基底上我們先鋪一層人工制備的抗原，然后把血清樣品加進(jìn)去，孵育一段時(shí)間后，特異性結(jié)合到抗體上；然后我們把它洗脫，留下特異性結(jié)合的抗體；這時(shí)候加入酶標(biāo)記的二抗，二抗能夠識(shí)別免疫抗體，它上面還帶催化作用的酶；然后再孵育一段時(shí)間，洗脫后留下特異性的二抗，加入一個(gè)底物會(huì)發(fā)生酶催化，從而導(dǎo)致顯色反應(yīng)的發(fā)生，使得溶液的顏色深淺發(fā)生變化。最終我們用產(chǎn)生顯色反應(yīng)的物質(zhì)的濃度，推導(dǎo)出你想檢測(cè)的抗體的濃度。這種方法，原理簡(jiǎn)單，特異性通過(guò)抗體識(shí)別來(lái)保證，不需要特別復(fù)雜的操作，可以自動(dòng)化或者半自動(dòng)化，實(shí)驗(yàn)通量不低。從這些孔中，顏色的深深淺淺，就可以算出抗體的多少。所以，這是一種定量的方法，也具備大規(guī)模篩查的能力。醫(yī)院里使用的化學(xué)發(fā)光法和這個(gè)原理比較像，只不過(guò)檢測(cè)的信號(hào)不太一樣。

另外一個(gè)方法是利用膠體金顯色進(jìn)行的試紙檢測(cè)方法，檢測(cè)是否懷孕的試紙用的也是類似的方法。這個(gè)方法的好處是非常簡(jiǎn)單、易用、便宜，而且不需要復(fù)雜的設(shè)備，速度非常快。

上圖是試紙條的結(jié)構(gòu)：樣品墊、膠體金結(jié)合墊、醋酸纖維素膜和吸收墊。如果要檢測(cè)的樣品包括你想檢測(cè)的抗體，比如新冠病毒的抗體IgM或者IgG，將樣品送入試紙，這時(shí)候在膠體金結(jié)合墊上有金標(biāo)抗原、金標(biāo)單抗，即膠體金聯(lián)合的抗原和單抗，一起向質(zhì)控線方向流動(dòng)，金標(biāo)單抗會(huì)結(jié)合到金標(biāo)單抗的抗體上，作為質(zhì)控的結(jié)果。如果這個(gè)樣品里面有這兩個(gè)待測(cè)抗體，它就會(huì)加到這兩個(gè)檢測(cè)線上，同時(shí)由于它能夠吸附金標(biāo)抗原，所以會(huì)顯色。如果顯色了，就知道是否樣品中存在待測(cè)抗體。如果IgG這條線很深，就知道有IgG；而IgM這條線顯色非常淺，可以認(rèn)為也許沒(méi)有這個(gè)抗體，這個(gè)結(jié)果能夠很簡(jiǎn)單地看懂。

為什么要做膠體金顯色檢測(cè)，是因?yàn)檫@個(gè)實(shí)驗(yàn)可以應(yīng)用于大規(guī)模篩查。很多地方要調(diào)查感染率，如果感染率高，多數(shù)人有抗體，那這個(gè)病毒就不容易傳播。如果感染率很低，大多數(shù)人沒(méi)有抗體，病毒就很容易傳播，這是為了更好地預(yù)防下一次的流行。

那么做了檢測(cè)就能得到想知道的結(jié)果嗎？這需要非常認(rèn)真地思考，因?yàn)闆](méi)有一個(gè)方法是完美的。分子檢測(cè)從來(lái)都不是完美的，這世界上沒(méi)有完美的檢測(cè)方法。要了解每一種檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)，以便更好地選擇和判斷。

首先，檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)非常重要。

上圖是前幾天《美國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)志》上刊登的一個(gè)示意圖。不同的檢測(cè)對(duì)象和疾病進(jìn)展間的關(guān)系有很大不同。病毒在發(fā)病前幾天才容易分離出來(lái)，那時(shí)候核酸載量是不多的。核酸檢測(cè)能檢測(cè)到嗎？咽拭子或者肺泡的灌洗液要比糞便檢測(cè)容易一些，但是糞便可能存在的時(shí)間長(zhǎng)一些，后期更容易檢測(cè)出來(lái)。抗體都是在發(fā)病后期才出來(lái)的，IgM抗體衰退比較快，IgG抗體衰退的慢，停留的時(shí)間會(huì)長(zhǎng)一些。所以選擇什么樣的檢測(cè)方法，跟時(shí)間節(jié)點(diǎn)有極其重要的關(guān)聯(lián)性，每一個(gè)方法有極限。我們?cè)诜治鲋薪?jīng)常用檢出限來(lái)表示檢測(cè)方法的靈敏度，檢出限就是在給定的置信度條件下可以從被測(cè)樣品中檢測(cè)待測(cè)組分的最小濃度或者最小量。比如基因編輯方法檢測(cè)技術(shù)跟傳統(tǒng)的計(jì)算方法比，檢出限比傳統(tǒng)的RT-PCR方法高一個(gè)量級(jí)左右。實(shí)際上現(xiàn)在大量使用的RT-PCR的檢測(cè)限非常低，也就是說(shuō)檢測(cè)的敏感性非常高，大概在一個(gè)反應(yīng)能夠檢測(cè)幾個(gè)核酸片斷的存在。絕大多數(shù)其它檢測(cè)方法，快的也好、慢的也好，不見(jiàn)得敏感性更好。

另外，要考慮一個(gè)檢測(cè)方法的特異性是否真的很好。核酸檢測(cè)中特異性取決于引物選擇的位置、引物序列與目標(biāo)核酸的匹配，還要考察是否真的能檢測(cè)出來(lái)。來(lái)自香港科學(xué)家的這篇發(fā)表在《臨床化學(xué)》的研究論文表明，兩個(gè)核酸檢測(cè)位點(diǎn)總，有一個(gè)位點(diǎn)明顯比另一個(gè)更加容易檢測(cè)出來(lái)，具體說(shuō)就是N蛋白基因比ORF1b更容易檢測(cè)出來(lái)，雖然一開(kāi)始設(shè)計(jì)上看好像這兩個(gè)位點(diǎn)的表現(xiàn)都差不多，但是真正使用的時(shí)候是有區(qū)別的。

雖然方法都不是完美的，但是它也有一定的可取之處，只要用的妥當(dāng)，找到號(hào)的適用場(chǎng)景。舉個(gè)例子，比如在人群中35個(gè)健康人、35個(gè)感染者，我現(xiàn)在做一個(gè)檢測(cè)，檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果35個(gè)，大家認(rèn)為這是很不錯(cuò)的結(jié)果，是吧？但事實(shí)卻不是這樣。檢測(cè)到的35個(gè)病人并不是真正的感染者。結(jié)果可以分成四塊：真實(shí)感染者檢測(cè)出來(lái)了，是真陽(yáng)性；健康人被算成感染者，是假陽(yáng)性；健康的人檢測(cè)出來(lái)健康，是真陰性；感染者未被檢測(cè)出來(lái)，是假陰性。所以真陽(yáng)性、假陽(yáng)性、真陰性、假陰性加在一起構(gòu)成了整個(gè)檢測(cè)樣本的總數(shù)。

怎么評(píng)價(jià)？第一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)：敏感性。所有的陽(yáng)性樣本中到底檢測(cè)出幾個(gè)陽(yáng)性？分子是真陽(yáng)性，分母是真陽(yáng)性和假陰性的和。結(jié)果25個(gè)真陽(yáng)性，10個(gè)假陰性，所以是71%的敏感度。

另一個(gè)指標(biāo)：特異性，也就是陰性的樣本中有多少個(gè)真陰性。真陰性和假陽(yáng)性一起當(dāng)分母，而分子是真陰性。結(jié)果是25個(gè)真陰性，10個(gè)假陽(yáng)性，一除還是71.4%。準(zhǔn)確度，就是真陽(yáng)性和真陰性的個(gè)數(shù)加起來(lái)除以總數(shù)，這樣算也是71.4%。很多場(chǎng)合我們都關(guān)心陽(yáng)性結(jié)果是否真的是陽(yáng)性？這就是所謂的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（PPV），就是說(shuō)當(dāng)你看到檢測(cè)結(jié)果，真陽(yáng)性和假陽(yáng)性都是陽(yáng)性，但是其中多少個(gè)是真陽(yáng)性呢？這個(gè)例子中，25個(gè)真陽(yáng)性，10個(gè)假陽(yáng)性，PPV也是71.4%。也就是說(shuō)測(cè)10個(gè)人大概有7個(gè)真陽(yáng)性的，另外3個(gè)是假陽(yáng)性。

剛才我舉了一個(gè)非常奇怪的例子，可以看到很多數(shù)值算出來(lái)都是相同的，一個(gè)原因是由于例子中假陽(yáng)性和假陰性測(cè)出來(lái)是一樣的。真實(shí)的檢測(cè)方法中間，不會(huì)特異性和敏感度都一定是一樣的。比如有這樣一個(gè)方法，也是同樣人群檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)所有的陰性樣本測(cè)出來(lái)都是陰性，但是陽(yáng)性樣本中有5個(gè)測(cè)出來(lái)陰性。這時(shí)候發(fā)現(xiàn)它的特異性是100%，也就是說(shuō)沒(méi)有假陽(yáng)性。它的敏感性是86%，準(zhǔn)確度是93%，PPV陽(yáng)性預(yù)測(cè)值是100%。雖然這個(gè)檢測(cè)有假陰性存在，但是它沒(méi)有假陽(yáng)性存在，所以測(cè)到的陽(yáng)性一定是陽(yáng)性，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值是100%。有沒(méi)有什么樣的方法和它比較接近呢？是有的。比如我們用的PCR方法，如果做好了，它可以把陽(yáng)性預(yù)測(cè)值做的很高。這是日內(nèi)瓦的一個(gè)非盈利組織FIND，對(duì)市面上的部分試劑盒做了一個(gè)客觀評(píng)價(jià)，可以看到不同地方產(chǎn)的試劑盒，檢測(cè)不同的基因位點(diǎn)，雖然檢出限有高有低，但總的來(lái)說(shuō)做的都非常好，特異性這個(gè)指標(biāo)都非常高，很多都是100%。有這樣的方法存在，你就知道拿到檢測(cè)結(jié)果時(shí)，至少陽(yáng)性預(yù)測(cè)值還是比較接近100%的。

剛才舉的例子都是陽(yáng)性和陰性樣本各占一半的例子。這個(gè)例子在現(xiàn)階段新冠病毒疾病的情況下有點(diǎn)極端，不太適用。為什么？因?yàn)殛?yáng)性預(yù)測(cè)值跟傳染性疾病的感染率有關(guān)。舉個(gè)例子，500人的群體里做檢測(cè)，如果檢測(cè)方法的敏感性是95%，特異性是95%，而這個(gè)群體感染率5%，結(jié)果是什么樣呢？真實(shí)的感染者應(yīng)該有25個(gè)，未感染者475人。但是檢測(cè)出來(lái)的結(jié)果是陰性452個(gè)，其中有1個(gè)假陰性，這個(gè)結(jié)果還好，說(shuō)明如果你測(cè)出來(lái)的結(jié)果是陰性的，你是真的陰性的概率是99.8%，這還是相當(dāng)不錯(cuò)的。但是，測(cè)陽(yáng)性的結(jié)果不容樂(lè)觀。本來(lái)只有25個(gè)陽(yáng)性樣品，愣是測(cè)出來(lái)了48個(gè)陽(yáng)性結(jié)果，其中24個(gè)真的，24個(gè)假的。所以真陽(yáng)性的概率50%，也就是說(shuō)，你的結(jié)果是陽(yáng)性的話，也有一半的可能你體內(nèi)并沒(méi)有抗體，你可不能出去瞎逛，還是老老實(shí)實(shí)待在家里比較好。

剛才說(shuō)的是感染率5%的情況，如果感染率達(dá)到25%，又會(huì)是什么結(jié)果？大概500個(gè)人里面應(yīng)該有125個(gè)感染者，測(cè)的結(jié)果里有6個(gè)假陰性、19個(gè)假陽(yáng)性。如果結(jié)果是陰性結(jié)果，大概98.3%的概率是真陰性，也還不錯(cuò)。如果是陽(yáng)性結(jié)果，真陽(yáng)性概率86%，說(shuō)明你還是有不小的可能，體內(nèi)沒(méi)有抗體，你還要出去瞎逛嗎？

剛才舉的例子是基于抗體檢測(cè)的試劑表現(xiàn)挺好的一個(gè)假設(shè)，即假設(shè)試劑的檢測(cè)敏感性95%、特異性95%，而這并不是那么好做的。

我們想象一下如果這倆指標(biāo)沒(méi)有那么高的情況吧。假設(shè)有一個(gè)大城市，感染率為1%，我們坐一個(gè)1000人的抗體檢測(cè)。所用的檢測(cè)試劑敏感性90%、特異性80%，這個(gè)值符合現(xiàn)在不少試劑的真實(shí)指標(biāo)。那會(huì)有什么樣的結(jié)果呢？1000人里面，因?yàn)楦腥韭适?%，所以真正有抗體的人應(yīng)該有10個(gè)，沒(méi)有抗體的人有990個(gè)。這10個(gè)人里面，由于檢測(cè)試劑的敏感性是90%，所以有9個(gè)檢測(cè)出來(lái)是真陽(yáng)性，1個(gè)是假陰性。在沒(méi)有抗體的人里面，因?yàn)闄z測(cè)的特異性是80%，所以其中990個(gè)人里面有792個(gè)被測(cè)成真陰性，但是198個(gè)人出現(xiàn)了假陽(yáng)性。所以，檢測(cè)結(jié)果出來(lái)后是這樣的，測(cè)了1000人，結(jié)果207個(gè)呈現(xiàn)陽(yáng)性，793個(gè)陰性。這說(shuō)明一個(gè)人如果測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果，實(shí)際上只有4%的幾率是真陽(yáng)性，有96%的可能性并不是陽(yáng)性。怎么改變這個(gè)狀態(tài)呢？根本的解決方法就是把試劑做的越來(lái)越好，比如說(shuō)再增加一些特異性。假設(shè)特異性增加到90%，這個(gè)結(jié)果就變了，假陽(yáng)性減少到99個(gè)人。但是這個(gè)結(jié)果，陽(yáng)性預(yù)測(cè)率只從4%提高到8%，陽(yáng)性結(jié)果中還是有90%以上的假陽(yáng)性。假設(shè)特異性增加到99%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)率可以增長(zhǎng)到47%左右。99%的特異性對(duì)抗體檢測(cè)來(lái)說(shuō)是很大的難題，因?yàn)檫@已經(jīng)是非常高的指標(biāo)了。這也是為什么檢測(cè)能力不夠理想的抗體檢測(cè)在感染率低的情況下做大規(guī)模篩查是有很大問(wèn)題和風(fēng)險(xiǎn)的，我們一定要把統(tǒng)計(jì)學(xué)的基本概念牢牢記在心里。

前幾天美國(guó)加州的一幫科學(xué)家聯(lián)合在一起組織了互助合作社，他們橫向比較了不同的抗體檢測(cè)方法，共進(jìn)行了12種方法，10種是試紙條，2種是酶吸附。試紙條里面很多是中國(guó)廠商的產(chǎn)品，也有美國(guó)廠家的產(chǎn)品，結(jié)果看上去都差不多，并沒(méi)有哪個(gè)特別一枝獨(dú)秀。所以并不是說(shuō)大家生產(chǎn)能力差別很大，而是這個(gè)方法的挑戰(zhàn)本身是普遍性的。

上圖可以看到敏感性，在早期的時(shí)候不是特別好，很可能是由于檢測(cè)的時(shí)候抗體本身濃度低，所以檢出率低。慢慢敏感性增加，后期大概80%或90%。特異性差別很大，有的相當(dāng)好，有的其中某個(gè)指標(biāo)很不錯(cuò)，有的綜合考慮起來(lái)的也還可以。大部分廠家在80%、90%左右，小樣本比較里，有的方法達(dá)到100%。所以抗體測(cè)試，尤其是膠體金測(cè)試中，總體上看，假陽(yáng)性率是一個(gè)大問(wèn)題。

如何做特異性測(cè)試呢，是利用新冠核酸陰性的樣品。因?yàn)闆](méi)有辦法從現(xiàn)在大規(guī)模流行進(jìn)行的時(shí)候的樣本中，找到真正的肯定的陰性樣本來(lái)做質(zhì)控，只好采用新冠肺炎之前，2018年7月份之前的樣本測(cè)試交叉檢驗(yàn)，最后看出來(lái)它到底會(huì)不會(huì)有陽(yáng)性的出現(xiàn)。他們做了很嚴(yán)格的比較，結(jié)果很有意思。

可以發(fā)現(xiàn)這些方法都相當(dāng)不錯(cuò)，他們的方法穩(wěn)定性都相對(duì)不錯(cuò)，只不過(guò)現(xiàn)在為止沒(méi)有哪個(gè)方法真的具備和核酸檢測(cè)一樣穩(wěn)定和優(yōu)秀的特異性，不能完全相信它的結(jié)果，所以假陽(yáng)性問(wèn)題一直會(huì)困擾我們。

最后花點(diǎn)時(shí)間講講是否有超越核酸檢測(cè)的其它檢測(cè)方法，比如測(cè)序。測(cè)序是過(guò)去幾年才被大家提上日程的檢測(cè)方法。過(guò)去幾個(gè)月，我們正好有一個(gè)方法基本成型了，1月份的時(shí)候我、清華的王建斌和我們中心謝曉亮教授一起發(fā)表了一篇論文，是由狄琳和傅語(yǔ)思兩個(gè)同學(xué)主要完成的。這個(gè)論文中報(bào)道了一個(gè)新的簡(jiǎn)便的RNA測(cè)序的處理方法，取名SHERRY。把樣品放進(jìn)去之后，用三步法就形成了測(cè)序，大大降低了以前這些對(duì)實(shí)驗(yàn)技巧要求非常高的實(shí)驗(yàn)操作的難度，可以使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定、可靠和快捷獲取。在新冠病毒肆虐的時(shí)候，醫(yī)院都在超負(fù)荷運(yùn)行，醫(yī)院的科研人員也沒(méi)有太多時(shí)間去想復(fù)雜的操作流程，所以越簡(jiǎn)單的操作流程越有利于為臨床新冠測(cè)序服務(wù)。過(guò)去幾個(gè)月，我們雖然不能全面復(fù)工，但是我們有幸和北京地壇醫(yī)院的合作者一起，在SHERRY基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了新方法，叫MINERVA，這個(gè)方法的出發(fā)點(diǎn)就是真從實(shí)際出發(fā)考慮，如何為臨床服務(wù)。這個(gè)方法不怎么挑樣本，咽拭子、痰、糞便都可以，經(jīng)過(guò)提取之后建立第一步的SHERRY文庫(kù)，再經(jīng)過(guò)富集等步驟就會(huì)有一個(gè)新的文庫(kù)做病毒全基因組測(cè)序。

通過(guò)這個(gè)測(cè)序我們研究了80多個(gè)樣本的核酸序列，從中可以看到之前很多沒(méi)有辦法用簡(jiǎn)單的核酸PCR檢測(cè)手段獲取的信息。我們看到了很有趣的現(xiàn)象，比如很多樣本在特定位點(diǎn)中都可能有不同的突變。這是一個(gè)全新的病毒，對(duì)這個(gè)病毒了解得越深刻，越有利于我們防控疫情，也為未來(lái)可能的威脅做好準(zhǔn)備。另外，我們并不知道這個(gè)病毒的突變是如何發(fā)生的。突變和疾病發(fā)展有什么關(guān)系？以后會(huì)不會(huì)影響到分子檢測(cè)試劑的研究？它的準(zhǔn)確度還能不能保證？突變是不是影響疫苗開(kāi)發(fā)？是不是影響藥物實(shí)驗(yàn)？這些我們都不知道，所以需要有更多工具來(lái)研究。

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的北京大学教授黄岩谊：新冠病毒实验室如何进行检测研究?的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。

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